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背景介绍

1. 联合国癌症统计及分析机构IRAC的数据显示,每年有超过1400万人罹患癌症、820万人死于癌症。(数据来源,世界卫生组织)

2. 2015年中国预计有429.2万例新发肿瘤病例和281.4万例死亡病例,相当于每天12000人新患癌症、7500人死于癌症。

2000~2011年中国所有肿瘤发病率趋势中显示:

在男性当中,5大最常见(67%)的肿瘤依次为肺癌、胃癌、食管癌、肝癌和结直肠癌。

在女性当中,5大最常见(60%)肿瘤依次为乳腺癌(15%)、肺癌、胃癌、结直肠癌和食管癌。

男性和女性肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、和结直肠癌五种最常见癌症死亡病例占所有癌症死亡病例的3/4。(数据来源,2015年中国癌症统计数据)

2015年中国不同年龄段人群癌症死亡例数(预测值)

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基因突变检测是肿瘤精准诊疗的基础

目前确定的300多个癌基因(oncogene)和抑癌基因(tumor suppressor gene)占比不足人类有2万多个基因的2%,不同肿瘤的突变数目存在较大差异。癌症由基因变异而产生,这些基因的变异导致正常细胞功能失控,从而引发癌变。

准确检测出变异既可了解癌症生成的机理,又是指导靶向治疗和免疫治疗的依据。根据特异的基因靶点可以正确地选择对应的药物和治疗手段。在癌症治疗过程中癌细胞将产生二次突变,对原先有效的药物产生了抗性。对患者的跟踪检测可及时发现二次突变的基因,从而在抗性产生前即可有针对性地调整治疗策略。

然而,实体病理组织中携带突变的癌细胞占所有细胞的比例可低至1-5%,而血液中从癌组织释放出来的突变DNA占总游离DNA的比例约为0.1-0.01%。因此,癌症分子检测必须同时满足多位点和高灵敏度两个要求 。


解决方案

为保证多位点和高灵敏度的要求对指定的基因位点进行富集后再进行高通量测序的技术称为定点重测序(target resequencing)。常用的位点富集方案有杂交捕获技术和多重PCR技术。

杂交捕获使用对位点区域具有特异性的核酸探针先将目的基因片段从溶液中分离出来,再进行扩增建库,是一种传统的方法,但由于捕获效率低,导致样本的使用量高,操作也较为复杂。

多重PCR技术使用对位点特异结合的PCR引物对目的基因片段直接进行扩增,操作简便、灵敏度高,是今后的发展趋势,但由于不同引物可能相互干扰,在同一个反应体系中难以集成较多的引物,导致均一性较差,对被检测的各位点的灵敏度不一,可能导致一些突变位点的漏检。

多重PCR的设计极为困难,仅有极少数公司拥有自创的多重PCR反应体系。

恒特基因自主研发了一个独特的多重PCR反应体系 - PANO-Seq®全景测序技术,这是一个新颖的一管双检高通量测序技术平台。


技术平台

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2019年12月6日,检验医学国际权威杂志《Clinical Chemistry》发表了恒特基因的核心技术文章《Simultaneous Detection of Gene Fusions and Base Mutations in Cancer Tissue Biopsies by Sequencing Dual Nucleic Acid Templates in Unified Reaction》(在同一反应体系内对两种核酸模板测序以同时检测癌症组织中的基因融合和碱基突变),该文章的发表,标志着恒特基因自主研发的检测技术(PANO-Seq®全景测序)得到国际学术界的认可。

 

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1000例肺癌组织样本检测结果汇总

 

该文章报道了一个1000例肺癌组织样本的队列中,PANO-Seq®全景测序技术鉴定到了全部的点突变(SNV)/插入缺失(indels)的热点,融合以及MET 14号外显子跳读和新颖或罕见的融合。相关变异的发生频率与既往报道相符合,且得到了其它方法验证。其中值得注意的一个融合变异事件为HLA-DRB1-MET,为在肺癌中检测到的全球第二例基因间MET融合,携带该变异阳性的患者可从克唑替尼靶向治疗中获益。

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PANO-Seq®全景测序是一个新颖的一管双检高通量测序技术平台,可以灵活地选择基因检测范围,在同一个反应体系里完成肿瘤基因变异情况的精确检测,在使用DNA模板检测基因突变、插入/缺失、拷贝数变异的同时,使用RNA模板检测基因融合/重排和表达,大大提高了检测的效率和灵敏度,而且不受融合伙伴限制,最大限度地避免了漏检。

 

论文结论:“这一方法不仅有益于大部分的携带核心可治疗靶标的患者,也给那些携带有罕见变异的患者带来获益。将来进一步扩展这一分析方法,使其能够检测靶基因的RNA表达和DNA拷贝数特征,如:程序性死亡配体1(PD-L1),为免疫检查点抑制剂的治疗提供额外的生物标志物信息。

 

 论文链接:http://clinchem.aaccjnls.org/content/early/2019/11/14/clinchem.2019.308833.long